Fosfataasi määramine piimas

Fosfataasi määramine piimas põhineb Piimanduse käsiraamatus toodud metoodikal (Türk, 2001). Ensüüm fosfataasi esinemise/puudumise järgi piimas on võimalik kontrollida piima pastöriseerimise efektiivsust: kas piim on piisavalt kõrgetel temperatuuridel pastöriseeritud ning ega juba pastöriseeritud piima hulka ei ole sattunud toorpiima. Piima termilise töötluse efektiivsust on võimalik hinnata viies laboratooriumis läbi fosfataastesti. Meetodeid testi läbiviimiseks on mitmeid. Käesolevas peatükis on käsitletud aluselise fosfataasi määramise meetodit (allikas: Piimanduse käsiraamat, 2001). Käesolev fosfataastest põhineb sellel, et aluseline fosfotaas laguneb tavalise piima pastöriseerimise ajal (kas 63 °C juures 30 minuti jooksul või 72 °C juures 15 sekundi jooksul), mistõttu piima kuumtöötlemise tulemusena aluselist fosfataasi piimas ei leidu ning fosfataasproovi tulemus on sel juhul negatiivne. Fosfataasproov töötab põhimõttel, et piimas esinev aluseline fosfataasensüüm vabastab fenooli dinaatriumfenüülfosfaadist. Eralduv vaba fenool annab oksüdeerija juuresolekul 4-aminoantipüriiniga roosa või punase värvuse. Sellisel juhul on fosfataasproov positiivne ning katses on tegemist toorpiimaga või pastöriseeritud piimaga, mille hulka on sattunud ka toorpiima. Antud meetod on laialdaselt kasutusel Eesti piimatööstustes kontrollimaks piima ja piimatoodete pastöriseerimise efekiivsust.

Katse käik (vaata ka alltoodud galeriid, kus ära toodud pildid selgitustega):

1. Katses vajaminevad töövahendid ja reaktiivid: katseklaasid korgiga, segisti, pipett, pipetiotsikud, töölahus, mis koosneb fenüülfosforhappe dinaatriumsoolast, 4-aminoantipüriinist, ammooniumkloriidist, ammoniaakveest ja destilleeritud veest, ning vask-tsink sadesti. Kontrolli kõikide vajaminevate töövahendite ja reaktiivide olemasolu labori töölaual.

2. Mõõta katseklaasi 9 ml uuritavat piimaproovi. Eelnevalt tutvu pipetiga: kuidas pipett töötab, kuidas pipetti käsitleda otsikute kasutamisel ja piimaproovi võtmisel ning katseklaasi piima lisamisel. Alltoodud video näitab, kuidas pipetti õigesti käsitleda katseseerias(http://www.youtube.com/watch?v=tL0acTneiNY) :

 

 

Kommentaar: pipeti maksimaalne mõõtühik on 1000 mikroliitrit (=1 ml). Et saada vajalikku kogust, mõõda pipetiga piima 9 korda katseklassi.

3. Lisada katseklaasi 2 ml töölahust. Töölahus tuleb pipeteerida võimalikult täpselt piima sisse. Piima ja töölahuse pipeteerimisel katseklaasi vahetada pipeti otsikut! Tähtis on vältida töölahuse saastumist piimaga. Väldi ka töölahuse sattumist katseklaasi suudmele või seintele. Töölahuse viimisel katseklaasi tuleb tagada, et lahus jõuaks täiel määral piima sisse. Sellisel juhul tagatakse proovide järgneval segamisel segistil täielik segunemine reaktiiviga. See annab katse läbiviimisel õige tulemuse.
4. Segada segistil katseklaasi sisu hoolikalt segamini. Kui piima või töölahuse pipeteerimisel sattus vedelik katseklaasi seinale, siis tuleb segistil segamisel tagada, et kogu vedelik seguneks. Sega proovi segistil umbes 30 sekundit, samal ajal toetades sõrmega katseklaasi korki.  Niiviisi on võimalik vältida vedeliku väljapaiskumist katseklaasist. Kontrolli ka segisti töökiirust. Segistil asuva valge nupuga on võimalik reguleerida segisti kiirust. Mida kiiremini segisti töötab, seda suurem on tõenäosus, et vedeliku segamisel hüppab lahus katseklaasist välja.
5. Asetada katseklaasid veevanni, mille temperatuur peab olema vahemikus 40...45 °C. Veevanni jäävad proovid 30 minutiks. Jälgi aega! Katseklaasid asetada veevanni selliselt, mis väldib nende ümberkukkumist vette. Katseklaasidel peavad olema peal korgid, mis ei lase veevanni kaanelt kukkuda proovi sisse kondensvett. Veevann tuleb tööle panna juba enne katse läbiviimist, mis tagab veevanni õige töötemperatuuri katse ajal. Veevannis mitte käivitada segistit, sest siis võib tekkida oht, et katseklaasid kukuvad veevanni pikali.
6. Lisada katseklaasi 5 ml tsink-vask sadestit. Selleks kasutame spetsiaalset pipetti, mis võimaldab lisada proovile  korraga 5000 mikroliitrit (= 5 ml) töölahust. Oluline on reaktiivi lisada õiges koguses otse piimaproovi sisse, vältides selle sattumist katseklaasi suudmele või seintele.
7. Segada segistil katseklaasi sisu segamini. Tuleb tagada kogu lahuse põhjalik segunemine. Sega proovi segistil umbes 30 sekundit, samal ajal toetades sõrmega katseklaasi korki.  Niiviisi on võimalik vältida vedeliku väljapaiskumist katseklaasist. Kontrolli ka segisti töökiirust. Segistil asuva valge nupuga on võimalik reguleerida segisti kiirust. Mida kiiremini segisti töötab, seda suurem on tõenäosus, et vedeliku segamisel hüppab lahus katseklaasist välja. Tähtis on tagada piima ja lisatud sadesti täielik segunemine, et saada katse tegemisel õige tulemus.
8. Asetada katseklaas veevanni, mille temperatuur peab olema vahemikus 40...45 °C. Veevanni jäävad proovid 10 minutiks. Jälgi aega! Katseklaasid asetada veevanni selliselt, mis väldib nende ümberkukkumist vette. Katseklaasidel peavad olema peal korgid, mis ei lase veevanni kaanelt kukkuda proovi sisse kondensvett. Veevann tuleb tööle panna juba enne katse läbiviimist, mis tagab veevanni õige töötemperatuuri katse ajal. Veevannis mitte käivitada segistit, sest siis võib tekkida oht, et katseklaasid kukuvad veevanni pikali.

9. Hinnata visuaalselt katseklaasi sisu värvust: kui katseklaasis olev vedelik on tumepunane, siis on tegemist toorpiimaga; kui valge või rohekas, siis tegemist on pastöriseeritud piimaga; kui heleroosa, siis on pastöriseeritud piima hulka sattunud toorpiima. Fosfataastest põhineb sellel, et aluseline fosfotaas laguneb tavalise piima pastöriseerimise ajal (kas 63 °C juures 30 minuti jooksul või 72 °C juures 15 sekundi jooksul), mistõttu piima kuumtöötlemise tulemusena aluselist fosfataasi piimas ei leidu ning fosfataasproovi tulemus on sel juhul negatiivne. Fosfataasproovi tulemus on aga siis positiivne, kui piimas esineb aluseline fosfataasensüüm, mis vabastab fenooli dinaatriumfenüülfosfaadist. Eralduv vaba fenool annab oksüdeerija juuresolekul 4-aminoantipüriiniga roosa või punase värvuse. Sellisel juhul on katses on tegemist toorpiimaga või pastöriseeritud piimaga, mille hulka on sattunud ka toorpiima.

Fotod: K. Meremäe (VL Toiduhügieeni labor)

Küsimused 

Mida näitab meile fosfataastesti negatiivne tulemus?


Kui fosfataasproovi tulemus on positiivne, kas peroksidaasproovi tulemus saab olla negatiivne?

Täiendav lugemine:

  1. Aluselise fosfataasi inaktiveerimine puhvris ja piimas teatud tegurite mõjul
  2. Aluselise fosfataasi aktiivsuse määramine pastöriseeritud piimas ja koores (Fluorimetric method).