Peroksidaasi määramine piimas

Peroksidaasi määramine piimas põhineb Piimanduse käsiraamatus toodud metoodikal (Türk, 2001). Ensüüm peroksidaasi esinemise/puudumise järgi piimas on võimalik kontrollida, kas piim on pastöriseeritud üle 80 °C või mitte, ning ega pastöriseeritud piima hulka pole sattunud toorpiima. Kui piim on piisavalt kõrgetel temperatuuridel (üle 80 °C) pastöriseeritud, siis ensüüm peroksidaas on inaktiveeritud, ja testi tulemus on negatiivne. See omakorda tähendab, et katseklaasi sisu värvus ei muutu. Peroksidaastesti tulemus on positiivne, kui toorpiima ei ole pastöriseeritud temperatuuril 80 °C või üle selle. Järelikult sellises piimas on ensüüm peroksidaas aktiivne. Kui piima on pastöriseeritud vähemalt temperatuuril 72 °C, siis ensüüm fosfataas on inaktiveeritud ja ensüüm peroksidaas on veel aktiveeritud, nii annabki fosfataastest negatiivse ja peroksidaastest positiivse tulemuse.

Katse käik (vaata ka alltoodud galeriid juhiste ja pildimaterjaliga):

1. Vajaminevad töövahendid ja reaktiivid: katseklaasid korgiga, segisti, pipett otsikutega, 0,5% kaaliumjodiidtärkliselahus ja 0,5% vesinikperoksiidilahus. Kontrolli kõikide vajaminevate töövahendite ja reaktiivide olemasolu labori töölaual. Kontrolli reaktiivide valmistamise aega.

2. Katseklaasi mõõta 5 ml uuritavat piimaproovi. Eelnevalt tutvu pipetiga: kuidas pipett töötab, kuidas pipetti käsitleda otsikute kasutamisel ja piimaproovi võtmisel ning katseklaasi piima lisamisel. Alltoodud video näitab, kuidas pipetti õigesti käsitleda katseseerias (http://www.youtube.com/watch?v=tL0acTneiNY):

Kommentaar: pipeti maksimaalne mõõtühik on 1000 mikroliitrit (=1 ml). Et saada vajalikku kogust, mõõda pipetiga piima 9 korda katseklassi.

3. Katseklaasi lisada 5 tilka 0,5% kaaliumjodiidtärkliselahust. Lahus tilgutada piima sisse. Töölahus tuleb pipeteerida võimalikult täpselt piima sisse. Samuti on tähtis lisada õige kogus reaktiivi piimaproovidesse. Piima ja töölahuse pipeteerimisel katseklaasi vahetada pipeti otsikut! Tähtis on vältida töölahuse saastumist piimaga. Väldi ka töölahuse sattumist katseklaasi suudmele või seintele. Töölahuse viimisel katseklaasi tuleb tagada, et lahus jõuaks täiel määral piima sisse. Sellisel juhul tagatakse proovide järgneval segamisel segistil täielik segunemine reaktiiviga. See annab katse läbiviimisel õige tulemuse.
4. Katseklaasi sisu segada segistil. Kui lahust tilkus katseklaasi seinale, tuleb tagada, et katseklaasi sisu segamisel piim lahusega korralikult seguneks. Sega proovi segistil umbes 30 sekundit, samal ajal toetades sõrmega katseklaasi korki.  Niiviisi on võimalik vältida vedeliku väljapaiskumist katseklaasist. Kontrolli ka segisti töökiirust. Segistil asuva valge nupuga on võimalik reguleerida segisti kiirust. Mida kiiremini segisti töötab, seda suurem on tõenäosus, et vedeliku segamisel hüppab lahus katseklaasist välja. Katseklaasi sisu värvus selles etapis ei muutu, olenemata sellest, kas tegemist on toorpiima või pastöriseeritud piimaga.
5. Katseklaasi lisada 5 tilka 0,5% vesinikperoksiidilahust. Lahus tilgutada piima sisse.Lahus tilgutada piima sisse. Töölahus tuleb pipeteerida võimalikult täpselt piima sisse. Samuti on tähtis lisada õige kogus reaktiivi piimaproovidesse. Piima ja töölahuse pipeteerimisel katseklaasi vahetada pipeti otsikut! Tähtis on vältida töölahuse saastumist piimaga. Väldi ka töölahuse sattumist katseklaasi suudmele või seintele. Töölahuse viimisel katseklaasi tuleb tagada, et lahus jõuaks täiel määral piima sisse. Sellisel juhul tagatakse proovide järgneval segamisel segistil täielik segunemine reaktiiviga. See annab katse läbiviimisel õige tulemuse.
6. Katseklaasi sisu segada segistil. Kui lahust tilkus katseklaasi seinale, tuleb tagada, et katseklaasi sisu segamisel piim lahusega korralikult seguneks. Sega proovi segistil umbes 30 sekundit, samal ajal toetades sõrmega katseklaasi korki.  Niiviisi on võimalik vältida vedeliku väljapaiskumist katseklaasist. Kontrolli ka segisti töökiirust. Segistil asuva valge nupuga on võimalik reguleerida segisti kiirust. Mida kiiremini segisti töötab, seda suurem on tõenäosus, et vedeliku segamisel hüppab lahus katseklaasist välja. Katseklaasi sisu värvus selles etapis muutub siis, kui tegemist on toorpiimaga. Kui katses kasutati pastöriseeritud piima, siis katseklaasi sisu värvus jääb valgeks.

7. Hinnata visuaalselt katseklaasisisu värvust: kui ensüüm peroksidaas on inaktiveeritud, siis katseklassi sisu värvus ei muutu; kui ensüüm peroksidaas ei ole inaktiveeritud piimas, siis katseklassi sisu värvub violetseks. Sellest tulenevalt: peroksidaastesti tulemus on negatiivne siis, kui katseklaasi sisu värvus jääb valgeks; peroksidaastesti tulemus on positiivne, kui katseklaasi sisu värvub siniseks. Testi tulemus on negatiivne siis, kui piim on piisavalt kõrgetel temperatuuridel (üle 80 °C) pastöriseeritud. See näitab, et ensüüm peroksidaas on inaktiveeritud.

Fotod: K. Meremäe (VL Toiduhügieeni labor)
 

Küsimused

Millisel pastöriseerimisrežiimil on võimalik ensüüm peroksidaasi piimas inaktiveerida?


Kui fosfataasproovi tulemus on negatiivne, kas peroksidaasproovi tulemus saab olla positiivne?

 

Täiendav lugemine:

Peroksidaasi määramine piimas (Storch test).